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蛋白定量與提取到底是怎么一回事兒?來看看吧

更新時(shí)間:2023-06-09  |  點(diǎn)擊率:808
  蛋白定量
  1、蛋白濃度測(cè)定
  蛋白定量的方法有很多種,應(yīng)用較多的主要有兩種:BCA蛋白定量檢測(cè)法和Bradford蛋白定量檢測(cè)法,市售的蛋白定量試劑盒也多基于上述兩種檢測(cè)方法而開發(fā)的。兩種方法均需配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,蛋白與定量試劑經(jīng)過一定時(shí)間的反應(yīng)(BCA法反應(yīng)為37℃、20-30min,Bradford法反應(yīng)一般為37℃,5min),酶標(biāo)儀讀取樣品的OD值,繪制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算WB蛋白的濃度。兩種檢測(cè)方法筆者均有使用經(jīng)驗(yàn),相比BCA法,Bradford法不僅節(jié)省反應(yīng)時(shí)間,也無需配置反應(yīng)試劑,簡(jiǎn)單、快速、好用,筆者推薦Bradford法測(cè)定蛋白濃度。
  嚴(yán)格來說,每次的蛋白濃度測(cè)定均需配制新鮮蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,保證每次測(cè)到的蛋白濃度的準(zhǔn)確性。然而,WB法評(píng)估蛋白表達(dá)水平本身就是一種半定量或者相對(duì)定量,因此在實(shí)際蛋白樣本準(zhǔn)本及濃度測(cè)定時(shí)只需保證均一性即可,即使用同樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算同一批蛋白的濃度,如果計(jì)算準(zhǔn)備即可保證蛋白上樣時(shí)內(nèi)參水平基本一致。因此,在實(shí)際操作中我們只需測(cè)定一次標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可用此曲線來計(jì)算后續(xù)實(shí)驗(yàn)蛋白的濃度,節(jié)省時(shí)間和試劑。
  2、蛋白濃度的調(diào)平
  有研究者喜歡計(jì)算添加loading buffer及變性以后的蛋白終濃度和上樣體積,然后在蛋白上樣時(shí)用loading buffer配平,保證上樣體積基本一致。而筆者更喜歡用loading buffer和蛋白裂解液調(diào)整蛋白濃度到基本一致(一般為1-2ug/ul)以后再變性,如此蛋白上樣時(shí)只需使用相同體積的蛋白樣品即可,筆者經(jīng)驗(yàn)是這樣的方法相對(duì)省時(shí)且不容易出錯(cuò)。
  蛋白提取
  1、蛋白裂解液與裂解環(huán)境
  現(xiàn)如今,商業(yè)化的蛋白裂解有很多中,有強(qiáng)效的、裂解時(shí)間短(約5-10min);也有普通的、裂解時(shí)間尚可(約30min);也有強(qiáng)效的,裂解時(shí)間極短(小于5min)。其中,上述裂解液的裂解環(huán)境,一般推薦為冰上或者4℃裂解,減少蛋白降解;而在蛋白裂解液中也推薦加用磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑,抑制細(xì)胞內(nèi)酶對(duì)蛋白的自然降解。
  對(duì)于普通蛋白的提取,如實(shí)驗(yàn)時(shí)間無特殊,選用普通的蛋白裂解液、冰上裂解即可;對(duì)于極易受環(huán)境影響的蛋白(比如低氧相關(guān)蛋白,HIF-1等),研究報(bào)道將細(xì)胞從低氧培養(yǎng)箱中取出2-3min即可影響HIF-1表達(dá),因此宜選用強(qiáng)效蛋白裂解液,并在低氧培養(yǎng)箱(37℃)中快速裂解。
  2、組織蛋白提取
  在組織蛋白提取過程中,一般推薦加用蛋白裂解液(磷酸酶和蛋白酶抑制劑)后,冰上研磨、勻漿化處理組織。組織來源不同,蛋白的產(chǎn)出亦不相同。歡迎各位留言,分享經(jīng)驗(yàn),比如1mg組織能產(chǎn)出多少蛋白。
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